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聚丙烯酰胺凝胶电泳

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  聚丙烯酰胺凝胶电泳(英语: polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE) ,是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术,用于分离蛋白质寡核苷酸。

  作用原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)和变性聚丙烯酰胺凝胶。

  在蛋白质的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开;在DNA的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,DNA呈双链状态泳动,其迁移率会受碱基组成和序列的影响。

  在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中,由于加入了变性剂——蛋白质变性剂常为SDS(SDS-PAGE),核酸变性剂常为尿素、甲酰胺等,故其分离仅依据于分子量大小。蛋白质的SDS-PAGE技术最初由shapiro于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子表面活性剂和强还原剂(SDS,即十二烷基硫酸钠)后,蛋白质亚基电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。SDS是阴离子去表面活性剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂巯基乙醇,二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

  SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。

  浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成一稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。

  此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。

  PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

  蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除,那电泳迁移率就取决于分子的大小,就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年,Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇,可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量, 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别,SDS与蛋白质结合后,还可引起构象改变,蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为18A(1A=10的负十次方米),这样的蛋白质—SDS复合物,在凝胶中的迁移率,不再受蛋白质原的电荷和形状的影响,而取决于分子量的大小由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测,纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度,一般只需要不到微克量级的蛋白质,而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况,这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

  在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

  所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素,当然其他的因素也可以从多方面考虑。

  根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

  1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样。

  2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,并在室温保温30min。

  3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。

  聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

  制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.8,分离胶选择pH8.8,选择Tris-HCl系统,TEMED与AP:AP 催化剂,催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺,催凝剂,加速AP催化作用十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

  聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。

  一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

  主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

  主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。此外可能是灌胶时分离胶过多导致浓缩胶很少,不能起到浓缩作用,没有把样品压成一条线。

  处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长,重新配制;降低凝胶浓度;灌胶时分离胶不要过多。

  “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

  处理办法:在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

  我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

  处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;

  这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上,可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。

  这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的。

  通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色。如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶。

  可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高。

  加入分离胶后,立即覆一层双蒸水,一是为了使分离胶界面保持水平,用水就可以把它压平,使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

  ⒘连续分离胶体系配制(凝胶板厚度0.75mm,长度10cm)100ml体系:双蒸水37.5ml

  1.聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(以后简称单体)在水溶液中聚合而成的亲水性高聚物,是一种透明而不溶于水并有韧性的凝胶。

  2.制备凝胶时需要的原料是:丙烯酰胺,亚甲基双丙烯酰胺(双体,用作交联剂)o在水溶液中用催化剂引发聚合。常用的催化剂有:二甲氨基丙腈(DMAPN);过硫酸铵四甲基乙二胺;过硫酸铵或加核黄素后用紫外光(波长253.7毫微米)引发聚合。

  3.聚合时丙烯酰胺分子通过加成反应形成长链,双体的作用是在长链之间形成交联,成为具有三维网状结构的凝胶(见图1)。所以在凝胶电泳中除了具有电泳的分离外还具有分子筛作用,从而增高了它的分辨能力。

  4.聚合时,根据分离的需要,可以用改变单体溶液浓度或增减双体比例的办法制成孔度大小不同的凝胶。在分离血清蛋白时,我们采用的丙烯酰胺总浓度为6.5%,内含单体96%,双体4.5%(T一6.5,c一4%)。

  5.聚合物分子中含有很多酰胺基,所以凝胶具有良好的亲水性,能在水中溶胀但不溶解。

  1)直流电源如果一次进行电泳的管数在20管以内可以用最大电流300毫安的整流器(硅或硒整流器),调压范围0—300伏。

  2)电泳装置包括二个缓冲液槽和电泳管。液槽可以用玻璃或塑料制成,在底部钻孔。插入电泳管,用有孔橡皮塞固定。电泳管选用孔径均匀一致的玻璃管切制。长10厘米,内径 ^5毫米。脱色用玻璃管长10厘米,内径8毫米。底部稍拉尖,用半透膜及橡皮圈套住底部。

  1)凝胶管的制备将电泳玻管用小橡皮塞塞住底部,然后灌入新配的凝胶溶液(方法见下文)。每管加至液体高度为7.5厘米。为了保证凝胶表面平整可用注射器通过细针头小心地加一层(高约1厘米)蒸馏水于表面上,勿使与凝胶液混合,室温放置。如果条件合适溶液于 30—60分钟内聚合而成凝胶。凝胶溶液的配制方法如下:溶液甲:丙烯酰胺(氯仿重结晶)25克,双体(甲醇重结晶)1克,加水配成100毫升溶液。必要时用三羟甲基氨基甲烷调pH至7.0。溶液乙:二甲氨基丙腈l毫升,三羟甲基氨基甲烷0.85克(也可用0.625克氨三乙醇或氨乙醇)加水至100毫升。溶液丙:K3Fe(cN)6分析纯0.075克,加水至100毫升新配。用作阻聚剂以延缓凝聚时间。使操作方便,如凝聚时间已足够长可以用蒸馏水代替。溶液丁:过硫酸铵(二级)2.8克加水至 100毫升新配。必要时用氨水调pH至7.0 c, 溶液甲及乙配后可在冰箱中保存数月。溶液丙及丁用时新配。临用前将溶液甲、乙、丙、丁等量混合。

  2)准备把已灌装凝胶的玻管通过有孔椽皮塞安装在上面液槽的底孔中,在上下两槽内分别注入缓冲液。装上后电泳管下端应浸没在下槽的缓冲液中,管下端勿留气泡。血清电泳可以用巴比妥缓冲液pH一8.6,离子强度0.05(配法:巴比妥钠10.3克,二乙基巴比土酸1.84克,加水至1升,温热使溶。加硫柳汞0.1克防霉)。

  3)加样在资料介绍的方法中,一般还在了这一步。在血清样品中加入少量蔗糖以增加密度,用血红蛋白吸管直接小心地加在凝胶表面上,加样量一般为7微升血清。如果在样品中混入少量溴酚兰指示剂就可以在电泳过程中观察前沿移动的情况。

  4)电泳在二液槽中安放铂金丝电极;正极在下,负极在上。接通电源进行电泳,电场强度10伏/厘米左右,视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。侍染料前沿移动至管底近处,停止电流。电泳时间为1一2小时。电泳完毕取下凝胶管,用细长针头沿管壁注蒸馏水,使凝胶与管壁剥开。然后用橡皮球压出凝胶条。

  5)染色及脱色电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小时以上。染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。置于脱色玻管中,在同一电泳装置中电解脱色。此时改用7%醋酸充装在液槽中。通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶,样品聚合在最后的另一层凝胶中(图2)。在我们的试验中省略的染料泳向正极。脱色时电场强度25伏/厘米,电流10—1 5毫安/管。3—4小时脱色完毕。增高电压可以加速脱色。有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤,即可除去染料,重新使用。

  6)保存与记录脱色后的凝胶可以装在盛有7%醋酸的有塞试管中保存数年。也可以自然干燥后保存,在需要观察时再浸在7%醋酸中溶胀成原来形状。记录可以用照相摄影。也可以用光密度计进行捕记。光密度计的分辨力决定于其狭缝宽窄及光电管放大倍数。

  为了选择血清蛋白电泳较合适的条件,我们分别对单体浓度、双体浓度、配制凝胶时所用不同正离子、各种电压、二甲氨基丙腈的浓度、过硫酸铵的浓度等条件进行了试验。根据以上试验结果,我们在分离血清蛋白时选用的条件是:单体浓度6.25-6.5%,双体占总丙烯酰胺量的4—5%,正离子采用三羟甲基氨基甲烷,二甲氨基丙腈及过硫酸铵浓度分别为0.25%及0.7%。电泳电压以7—10伏/厘米较为合适。但电泳时间较长,约2—3小时,室温低时可以电压稍高。如果室温较高则可以在冰箱中进行电泳。

  采用上述条件我们进行了正常人血清的凝胶电泳。一般可以分成15—20条区带。我们也根据RaFmand介绍的两向电泳方法比较了纸电泳和凝胶电泳各区带的相对关系。纸电泳上的a:区带在凝胶电泳中可被分离成10条以上区带。但纸电泳中d,区带的一部分则与凝胶电泳中自蛋白区带相重合。二种电泳方法所得的图谱见图版9。在正常人血清中后白蛋白(PA)、转铁蛋白(Tr)和触珠蛋白(HP)均有不同的型, 一例骨髓瘤病人血清的和凝胶电泳自由电泳图谱的比较见图版11、12。我们也比较了酒精分划人血浆各部分的纸电泳和凝胶电泳图谱,结果见图版13。从图中可见在纸上电泳检定时看来较纯晦白蛋白和丙种球蛋白部分,在凝胶电泳中可见明显的其他蛋白区带。

  3.放射病狗血清蛋白电泳的观察 放射病动物血清蛋白的改变可以在纸电泳中观察到。一般认为狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝胶电泳观察可以得到更深入的资 料。正常狗血清的凝胶电泳图谱大致与人相 似。狗受致死量照射后第九天有明 显变化,至极期时则可以观察到鸭、Tr、融及 sp等区带有明显增高。我们用胎3—10型光 谱仪用光密度计将电泳图谱进行了扫描,所得 结果见图3,图版14。由于仪器的限制光缝 最小只能达到0.5毫米,从而影响了其分辨力。但与正常血清对比可以见到其改变的情况,这 远比纸电泳中所见更为明显。我们认为如果联 系临床表现对变化的本质进行一些研究,将有 助于了解放射病极期来到前后体内蛋白质代谢的一些情况。

  4.在分离正常人尿DNase时的凝胶电泳 观察 用葡聚糖凝胶分离人尿中DNase时可以除去大部分其他蛋白质和杂质。但分离所得的制品用凝胶电泳观察还可以见到五条以上的蛋白质区带(见图版14)。将凝胶条在未染色前置于含大分子DNA的琼脂平板上,在37c’温箱中保温2—3小时,再用5%三氯醋酸加至如此处理过的琼脂板上,可以看到乳白色本底上出现被酶水解后的透明斑点。将凝胶条用氨黑染色后显示其蛋白区带的位置。二者比较就可以确定具有酶活性的成分的相应电泳位置。我们的试验中观察到人尿DNase在凝胶电泳中至少被分离成二条以上有酶活性的区带。说明有同功酶的可能。应用这一方法可以较深人地观察体液中酶的情况。同时也说明可以用凝胶电泳来指示生物制剂制备过程中纯化的情况。

  本文介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的一些初步实验条件和实验结果,并与纸电泳、自由电泳等进行了对比。从结果中可以看到聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力较强,重演性良好。它在临床生化分析及生物活性物质的分离、制备中和纯度鉴定中具有较广泛应用的可能性。